Utilisation des bactériophages pour le contrôle de Staphylococcus aureus dans les produits laitiers


Staphylococcus aureus est le principal agent responsable du rejet de lots de fromages tel que déterminé par le MAPAQ au cours des dernières années. Les bactériophages (ou phages) sont des virus qui s'attaquent spécifiquement aux bactéries et les détruisent. Ils sont les entités biologiques les plus abondantes sur terre. On en retrouve dans le lait cru, incluant des phages spécifiques à S. aureus. L'utilisation de phages pour la prévention et le traitement d'infections bactériennes se fait depuis les années 1920 et cette pratique est encore courante dans certains pays. Des phages sont aussi utilisés dans des applications alimentaires ou agricoles. En juin 2012, Santé Canada a homologué un premier produit à base de phages naturels destiné à réprimer le chancre bactérien causé par Clavibacter michiganensis sur les tomates cultivées en serre. C'est en août 2006 que la première approbation en Amérique du Nord d'une préparation de phages fut autorisée par la FDA pour éliminer Listeria monocytogenes des aliments. La FDA a depuis accepté d'autres produits à base de phages pour contrôler E. coli et Salmonella dans des applications alimentaires. Soulignons que les toxi-infections nécessitent souvent de consommer une certaine dose de l'agent microbien indésirable. Il n'est donc pas nécessaire de complètement éliminer la bactérie indésirable pour que l'action protectrice soit un succès. De plus, aux faibles quantités requises, les phages ne changent pas les propriétés des aliments. Nous proposons des phages pour contrôler S. aureus dans les produits laitiers.

Approche de recherche et résultats

Objectif 1: Caractérisation d'une collection de souches de S. aureus. 42 souches de S. aureus issues du milieu laitier au Canada ont été caractérisées (MLST, toxines, lysotypie). Nous avons également caractérisé 15 autres souches de S. aureus de divers environnements, dont 10 souches résistantes à la méthicilline de Santé Canada. Au total, 57 souches de S. aureus ont été analysées et comparées dans ce projet. L'analyse des séquences MLST a identifié 14 différents complexes clonaux (CC) et 18 séquence-types (ST). Les souches de S. aureus isolés du milieu laitier sont groupées en 3 CCs dont la majorité appartiennent à CC151 et CC97.

Objectif 2: Caractérisation d'une collection de phages virulents de S. aureus. Nous avons caractérisé 14 phages de S. aureus : 6 de la famille des Myoviridae, 6 Siphoviridae, et 2 Podoviridae. Trois de ces phages ont été isolés du lait cru québécois et un autre d'eaux usées. Certains phages peuvent être produits en infectant une souche non pathogène de Staphylococcus xylosus qui est utilisée dans des produits carnés fermentés. Les myophages infectent plus de 50 des 57 souches testées. Le génome de tous ces phages a été séquencé et un des phages a été retiré puisqu'il possède des gènes codant pour une toxine (PVL). Trois autres phages ont aussi été écartés puisqu'ils infectent peu de souches de S. aureus. Finalement, deux autres phages ont été enlevés puisqu'ils ressemblaient fortement à un autre de nos phages. Ainsi, 8 phages de S. aureus ont été sélectionnés.

Objectif 3: Stabilité des phages de S. aureus au traitement thermique et à la matrice fromagère. Après un traitement de pasteurisation (73 ºC, 20 sec), le titre des phages a diminué de 1 à 4 logs selon le phage. les phages isolés du lait cru ont été les plus résistants au traitement thermique. Les phages anti-staph devront être ajoutés après la pasteurisation. Les phages de S. aureus sont stable dans une matrice fromagère (1.8% sel, 39% humidité, pH 5.5, 4C) pendant 28 jours.

Objectif 4: Fabrications fromagères avec phages et S. xylosus (un simulant de S. aureus). Les phages sont plus stables dans le lait pasteurisé que dans du lait microfiltré et du lait cru. La caséine micellaire est responsable en partie de l'inefficacité des phages antistaph dans le lait cru. Lors de mini fabrications fromagères, il a été démontré que la majoritédes phages est retenue dans le caillé. Un des phages a pratiquement éliminé S. xylosus après 28 jours d'affinage du fromage à 4C. En absence de phages, la concentration de S. xylosus était de 107 ufc/g. Les phages n'ont pas eu aucun impact sur la composition des fromages.

Objectif 5: Encapsulation des phages dans des billes d'alginate. La microencapsulation (ME) dans des microbilles (500 µm) d'alginate-calcium a permis de concentrer les suspensions phagiques par un facteur de 6. Les phages ont très bien résisté à la congélation (-20C) lorsqu'encapsulés. Mais un résultat opposé a été obtenu suite à la lyophilisation.

Objectif 6: Fabrications fromagères avec phages et S. aureus. Un mélange de 3 phages (myophage, podophage et siphophage) a été testé contre une souche de S. aureus durant une mini-production de fromage de type Cheddar en laboratoire. Du lait entier pasteurisé a été contaminé avec 10e6 ufc/ml de staphylocoques et le fromage affiné pendant 14 jours à 4C. Le mélange de phages a été ajouté au lait pasteurisé à une multiplicité d'infection (MOI) de 15, 45 et 150. Après l'affinage pendant 14 jours, le compte bactérien a chuté de 10000X avec le MOI de 15 et en dessous de la limite de détection (100 ufc/ml) pour les deux autres MOI.

Retombées

Nous pouvons maintenant identifier, caractériser, et énumérer des phages de S. aureus. Nous pouvins différencier des souches de S. aureus. Nous avons construit des mélanges efficaces de phages de S. aureus. La production commerciale des phages peut s'effectuer sous forme congelée. Finalement, nous connaissons le comportement des phages dans divers types de laits ainsi que lors du processus de fabrication fromagère. Ainsi, nous proposons une alternative pour réduire la population de S. aureus dans les produits laitiers.

Chercheur responsable

Sylvain Moineau, Université Laval

Équipe de recherche

  • Claude P. Champagne, Centre de recherche et de développement sur les aliments
  • Steve Labrie, Université Laval
  • Daniel St-Gelais, Centre de recherche et de développement sur les aliments

Année du concours

2011

Durée

3 ans

Montant

106 852 $

Partenaires financiers

  • Agriculture et Agroalimentaire Canada
  • Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation du Québec
  • Novalait inc.

Appel de propositions

Innovation en production et en transformation laitières – V