Cibles et mécanismes pour la dégradation des ARN messagers médiée par les petits ARN nucléolaires

 

Michelle Scott

Université de Sherbrooke

 

Domaine : organismes vivants

Programme projet de recherche en équipe

Concours 2018-2019

Les petits ARN nucléolaires (snoRNA) sont des ARN non-codants régulateurs bien caractérisés pour leur rôle dans la modification de l'ARN ribosomal, une étape importante pour la biogénèse des ribosomes. Cependant, durant la dernière décennie, des études variées ont mis en évidence plusieurs autres mécanismes régulatoires des snoRNA. En particulier, un snoRNA a été démontré comme régulant la stabilité d'un ARN messager (ARNm) par liaisons multiples à un de ses introns et recrutement de l'exosome nucléaire. Nous avons identifié un deuxième tel snoRNA dont la déplétion résulte en l'augmentation de l'abondance de transcrits spécifiques et dont l'interaction avec ces transcrits a été confirmée par une méthodologie de cartographie de la structure du transcriptome (méthodologie PARIS). Nous posons donc comme hypothèse que les snoRNA régulent l'expression des gènes à grande échelle en modulant la stabilité des transcrits par liaison directe et recrutement de facteurs de dégradation. La possible régulation à grande échelle de la stabilité des pré-ARNm par les snoRNA doit être approfondie car elle changerait de façon importante notre compréhension de la régulation de l'expression des gènes.

Pour ce faire, nous proposons les objectifs suivants :

  1. Identification à haut débit d'interactions fonctionnelles snoRNA-ARNm. La combinaison de la méthodologie PARIS qui détecte les duplex d'ARN in vivo, chez l'humain et le rat, et des analyses de corrélation d'expression du snoRNA et de ses cibles dans diverses lignées cellulaires permettra l'identification d'interactions conservées de snoRNA résultant en changement d'abondance d'ARNm cibles. Ces interactions fonctionnelles seront validées par déplétion de snoRNA d'intérêt en utilisant des oligonucléotides antisenses et confirmation par transcriptomique de l'effet sur les cibles d'ARNm. L'intrégration des données d'interaction ARN-ARN, des données de conservation et des analyses de corrélation permettra de créer un prédicteur des cibles des snoRNA;
  2. Caractérisation des facteurs cis et trans requis pour la dégradation des transcrits médiée par les snoRNAs. Pour caractériser les séquences importantes pour cette régulation sur la cible et sur le snoRNA, les données d'intéraction ARN-ARN à grande échelle PARIS seront analysées, permettant la détermination du site d'interation de façon précise. Certains sites de ciblage de snoRNA sur les transcrits seront validés expérimentalement par cross-linking puis seront caractérisés par analyse bio-informatique par comparaison de la structure et de la séquence du snoRNA et de sa cible ainsi que par génomique comparative et étude de co-variation. Les résidus les plus importants pour l'interaction seront validés par mutation des cibles ou des snoRNA pour investiguer leur effet sur la régulation. Par ailleurs, la voie de dégradation des transcrits ciblés par les snoRNA sera caractérisée par déplétion systématique d'exonucléases et d'endonucléases et de protéines liant l'ARN, en présence et en absence des snoRNA, permettant de déterminer les protéines qui influencent la stabilité des ARNm de manière snoRNA-dépendante.  Les délétions de snoRNA se feront par CRISPR.

Ces analyses détermineront l'étendue d'utilisation de ces mécanisme de régulation de l'expression des gènes et pourraient révéler l'existence d'un tout nouveau niveau de régulation dont il sera important de tenir compte pour notre compréhension du fonctionnement de toutes les cellules.